ASPECTOS GENERALES EN TOMA DE MUESTRAS BACTERIOLÓGICAS

Introducción

La recolección de las muestras es una parte fundamental en cualquier análisis clínico ya que para obtener buenos resultados la etapa preanalítica debe ser llevada con exactitud para una buena obtención de especímenes.

Al obtener una muestra para el área de bacteriología hay que tener en cuenta los siguientes aspectos:

  • La muestra debe ser representativa del proceso que se estudiara.
  • Debe ser suficiente para asegurar el examen completo.
  • Debe obtenerse de preferencia antes de la terapia antimicrobiana.
  • La muestra se debe tomar del sitio donde haya mejor posibilidad de encontrar.
  • Se debe asegurar que no exista contaminación externa.
  • Recoger la muestra en el estadio de la enfermedad adecuado.
  • Emplear material estéril para la recolección.

Las causas más frecuentes de fracasos en bacteriología se deben a:

  • Fallo de la técnica de cultivo.
  • Toma de muestra inadecuada.
  • Transporte de muestra incorrecto.

Tipos de muestras

Las muestras se pueden clasificar de la siguiente forma:

  1. Muestras obtenidas de sitios con microbiota (mucosas): se debe tener en cuenta a la microbiota a la hora de interpretar los resultados.
  2. Muestras de zonas normalmente estériles pero que para su obtención pasa por lugares no estériles (orina, secreciones del tracto respiratorio inferior): la muestra debe obtenerse lo más asépticamente posible para evitar la contaminación.
  3. Muestras de zonas estériles: como sangre y líquidos biológicos.

Principales muestras

En la siguiente tabla se colocan las principales muestras, así como su conservación y los agentes patógenos que habitualmente se aíslan.

Manejo de las muestras

Una vez obtenida la muestra es necesario que se inocule en los medios de cultivo adecuados, en caso de no poder hacerlo se mantienen en conservación a una temperatura de 4°C a 6°C, sin embargo, algunos autores mencionan que muestras de sangre o LCR se pueden mantener en incubación a 37°C, ya que, al provenir de lugares estériles se presume que si un microorganismo está presente se trata de un patógeno y con la incubación aumentaría su carga microbiana.

Otra alternativa que se puede emplear es el uso de medios de transporte, especialmente para muestras de exudados faríngeos, heces o exudados vaginales. Estos medios contienen un medio de cultivo semisólido sin nutrientes con un agente reductor que permite que el microorganismo sobreviva ya que el agente reductor inactiva enzimas autodestructivas, evita la oxidación y deshidratación, el más conocido es el medio de transporte Stuart que contiene un agar semisólido amortiguado con tioglicolato como agente reductor.

Bibliografía consultada

LÓPEZ LÓPEZ, R. (2001) ‘Manejo y transporte de muestras en microbiología’, OFFARM. Doyma, 20(8), pp. 122–127.

Winn, W. C. and Koneman, E. W. (2008) Koneman diagnóstico microbiológico : texto y atlas en color. Editorial Médica Panamericana.

Recomendaciones para la realización del extendido de sangre periférica

Introducción

El extendido de sangre periférica es una herramienta hematológica básica y altamente informativa a disposición del médico en el cribado, diagnóstico y seguimiento de la progresión de una enfermedad y la respuesta terapéutica. Desafortunadamente, como resultado de la automatización el extendido de sangre periférica a quedado en segundo plano llegando a no realizarse en muchos laboratorios y si se realiza es muy pobre en la información que brinda. Debemos recordar que los equipos automatizados son buenos contadores, pero no perfectos y nunca sustituirán a un estudio cuidadoso del extendido d sangre periférica.

Recomendaciones para la realización de un extendido manual

  • Preanalítica

Para tener resultados fiables y precisos es necesario cuidar las variables preanalíticas que afectan en la obtención de un buen extendido sanguíneo. Se pueden usar dos tipos de muestra de sangre:

  1. Sangre capilar: presenta la ventaja que no se generan alteraciones por anticoagulante u almacenamiento, pero presenta la desventaja de que si no se tiene experiencia en realizar extendido puede que no sea suficiente muestra y además es común encontrar plaquetas agregadas.
  2. Sangre venosa anticoagulada con EDTA: es la muestra que más se emplean, las plaquetas no se observan agregadas y se pueden realizar varios extendidos, pero se generan artefactos por el anticoagulante y almacenamiento.

Para realizar un extendido de sangre periférica anticoagulada se debe tener cuidado de respetar el volumen anticoagulante:muestra y de ser posible realizar inmediatamente el extendido después de tomar la muestra o cómo máximo antes de dos horas de haberse tomado para evitar la generación de artefactos. No se recomienda la realización de extendidos con sangre anticoagulada con heparina ya que se pueden formar grupos de plaquetas y la tinción se torna azulosa, el citrato de sodio se recomiendo cuando se observa satelitismo plaquetario o agregados de plaquetas por una probable pseudotrombocitopenia causada por EDTA.

  • Analítica

La técnica de extendido en cuña es la más utilizada, debe ser realizada por personal capacitado para tener una buena distribución de células. Para realizar el extendido con está técnica se utiliza una pipeta automática y portaobjetos de alta calidad, el portaobjetos que servirá como extensor deberá ser un poco más pequeño (se emplean portaobjetos con bordes biselados) para que los extremos del extendido no toquen los bordes de los portaobjetos, a continuación, se describe la técnica para realizar un extendió en cuña:

  1. Mezclar la sangre haciendo 10 inversiones suaves y colocar 5 µl de sangre a 1 cm del borde del portaobjetos (esta zona se ocupará para identificar el extendido).
  2. Sujetar el portaobjetos extensor con el índice y pulgar en un ángulo de 30° a 45° y colocarlo delante de la gota de sangre.
  3. El portaobjetos extensor deslizarlo hacia atrás para que entre en contacto con la gota y esperar a que se llene el borde por capilaridad.
  4. Deslizar el portaobjetos extensor en un solo movimiento suave y continuo hasta el otro extremo del portaobjetos.
  5. Dejar secar por 30 minutos y teñir

Características de un extendido sanguíneo bien realizado

  • Aproximadamente dos tercios a tres cuartos de la longitud del portaobjetos están cubiertos por el extendido.
  • Está ligeramente redondeado en el borde del extendido (parte delgada), no tiene forma de bala.
  • Los bordes laterales del extendido deben ser visibles.
  • Es suave sin irregularidades, agujeros ni rayas.
  • Cuando el extendido se sostiene a contraluz, el borde delgado debe tener una apariencia de “arcoíris”.
  • Se recoge y se esparce toda la gota.

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de un extendido bien hecho que está encerrado en un recuadro rojo y los demás son extendidos no realizados correctamente

Lectura del extendido

Una vez teñido y seco se procede a la lectura del extendido, la zona a estudiar se encuentra cercana a la terminación del extendido, los eritrocitos de la zona de lectura se deben observar en su mayoría esparcidos y unos cuantos están agregados o juntos, esta zona se busca con los objetivos de 10x y 40x y una vez localizada se procede a la lectura a 100x. En el siguiente esquema se muestra la ubicación de la zona ideal de lectura.

Bibliografía consultada

Campuzano Maya, G. (2008) ¿Cómo obtener un extendido de sangre periférica de óptima calidad?. Medicina & Laboratorio, 14 (3-4).

Adewoyin, A. S., & Nwogoh, B. (2014). Peripheral blood film – a review. Annals of Ibadan postgraduate medicine, 12(2), 71–79.

Keohane E.A., Smith L., Walenga J. (2016). Rodak’s hematology: clinical principles and applications. (5th ed.). St. Louis: Saunders Elsevier.

Velocidad de sedimentación globular o eritrosedimentación

Introducción

Sus primeras observaciones fueron realizadas en 1918 por Fahraeus, en 1894 Edmund Biernacki demostró su utilidad clínica y posteriormente en 1921 Alf Westergren propuso un método para medirla que hoy en día se considera el método de referencia. Es una prueba frecuentemente solicitada, es barata y sencilla de realizar. Esta prueba se utiliza para evaluar si existe un proceso inflamatorio en fase activa, ya que el aumento de las proteínas conocidas como reactantes de fase aguda, provocan un cambio de la carga en la membrana de los eritrocitos lo que provoca que sedimenten con mayor rapidez.

Fisiología de la sedimentación de los eritrocitos

La sedimentación de los eritrocitos ocurre en tres etapas, en la primera fase se forma pilas de moneas (Rouleux), en la segunda fase se forman esferas de agregados y en la última etapa las esferas sedimentan al fondo. Para que ocurre este fenómeno, interactúan propiedades del eritrocito y del plasma:

  • Los eritrocitos normalmente tienen una carga negativa en su membrana (potencial z) lo que permite que se repelen uno a otro y que la VSG sea inferior a 10 mm/hora. Pero si situaciones donde existe variación en el tamaño del eritrocito o en la cantidad la VSG se puede modificar. Por ejemplo, los eritrocitos grandes tienen menor carga y los pequeños lo contrario, por lo tanto, los pacientes con macrocitosis la VSG se aumenta y con microcitosis se disminuye. Otro ejemplo, los pacientes con anemia drepanocítica, ya que la alteración morfológica de estas células provoca que la VSG sea lenta a pesar de que existan situaciones donde debería estar elevada.
  • El aumento de las proteínas plasmáticas, principalmente los reactantes de fase aguda, disminuyen el potencial Z provocando el aumento de la eritrosedimentación. Las proteínas que se ha observado que contribuyen significativamente a este fenómeno son el fibrinógeno y las inmunoglobulinas. Por otro lado, la presencia de sustancias en el plasma como la lecitina, ácidos grasos y medicamentos como la quinina, fenilbutazona, salicilato de sodio y tiosemicarbazona disminuyen falsamente la VSG.

Métodos de determinación

Existen distintos métodos para determinar la VSG y a continuación se describen brevemente:

  1. Método de Westergren: es el método de referencia según lo recomendado por la ICSH y CLSI, este método consiste en poner sangre anticoagulada con EDTA en un tubo largo de 300 mm de largo por 2.5 mm de ancho, se coloca en posición vertical y se deja reposar por una hora, la distancia que recorre el paquete eritrocitario en una hora se expresa en mm6.
  2. Método de Wintrobe: En este método de coloca la sangre anticoagulada en un tubo de Wintrobe de 3 mm de ancho que esta graduado de mm a mm en una escala de 0 a 10 cm. Se deja reposar por una hora en una gradilla de tubos Wintrobe perfectamente nivelada y al termino de la hora se cuentan los mm que se desplazó el paquete eritrocitario.
  3. Microeritrosedimentación: este método es especialmente útil en pacientes que no se les puede obtener mucha muestra. Este método consiste en recolectar una muestra con un tubo capilar de 75 mm de largo por 1.1 mm de diámetro interno, el cual debe estar heparinizado, se sella con plastilina un extremo y se deja reposar por una hora, posteriormente se mide el desplazamiento del paquete con una regla milimétrica.

Estos métodos manuales presentan varias desventajas, en los dos primeros es necesaria una cantidad considerable de sangre para llenar los tubos, presenta un alto riesgo de infección, se debe esperar una hora para otorgar resultados. Además, pueden presentar inconsistencias, si no existe un buen mezclado de la muestra, el tubo se encuentra inclinado, existen vibraciones durante la sedimentación pueden interferir en estas pruebas.

Intervalos de referencia

Los valores de referencia varían según la edad, aunque ciertas condiciones como el embarazo, el parto y el puerperio pueden afectar los valores. En la siguiente tabla se muestran los valores de referencia.

Utilidad clínica de la velocidad de sedimentación globular

En cualquier proceso en el que exista un proceso inflamatorio activo la VSG se aumentará, en la siguiente tabla se muestran los principales padecimientos vinculados a la disminución o aumento de la VSG.

Bibliografía consultada

Navarro, María. (2019). VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR: MÉTODOS Y UTILIDAD CLÍNICA. Comunidad y Salud, 17(2).

Campuzano MG. Eritrosedimentación: réquiem para una prueba. Medicina & Laboratorio. 2010;16(01-02):11-40.

Procalcitonina

Introducción

La procalcitonina fue descrita en 1984, pero hasta 1993 empezó a ser usada como un biomarcador, tiene una utilidad clínica importante ya que se forma es estados inflamatorios sistémicos y es muy útil en el estudio de la sepsis. Los valores aumentados de este parámetro se asocian a la gravedad de la enfermedad y su disminución con el pronostico favorable de la misma. Se utiliza principalmente para evaluar las enfermedades de origen infeccioso provocadas por bacterias, aunque su utilidad se expande a más padecimientos.

Bioquímico y fisiología

La procalcitonina es una proteína precursora de la hormona calcitonina, es un péptido de 116 aminoácido que tiene un peso de 14.5 kDa. Se codifica en el gen de Calcitonina 1 (CALC-1) que se encuentra en el cromosoma 11, la síntesis de esta proteína de restringe a las células C de la tiroides y otras células neuroendocrinas. Pero, se activa su producción en tejidos parenquimatosos en respuesta a una infección bacteriana, esto es mediado por la IL-6, TNF-α y la IL-1β. Estos tejidos no tienen la capacidad de dividir a la procalcitonina para generar su forma madura (calcitonina) y de esta forma se acumula. Caso contrario sucede en los procesos inflamatorios de origen viral, ya que en estas circunstancias se produce interferón-γ que atenúa su producción.

Figura 1. Estructura de la procalcitonina.

Valores de referencia e interpretación

Su concentración sérica en personas sanas es <0.1 µg/l, en procesos infecciosos se eleva y su concentración se relaciona a la gravedad de la enfermedad. Los pacientes con infecciones localizadas tienen niveles más bajos que los que tiene sepsis generalizada, sepsis grave y shock séptico. La procalcitonina es detectable después de 3-4 horas iniciada la infección y alcanza su pico a las 6-12 horas. Es importante interpretar esta prueba en el contexto adecuado ya que las infecciones no son la única causa de su elevación. En la siguiente tabla se explica la forma de interpretar este parámetro en los procesos infecciosos.

Limitaciones de la procalcitonina

Es ampliamente sabido que es un parámetro útil en los procesos inflamatorios bacterianos, pero no es la única condición en la que se encuentra elevado, a continuación, se enlistan los padecimientos en los que este parámetro se encuentra elevado:

  • Traumatismos
  • Quemaduras
  • Carcinomas
  • Shock cardiogénico
  • Primeros dos días de vida de un neonato
  • Durante la diálisis peritoneal
  • Cirrosis
  • Enfermedades autoinmunes

Procalcitonina y el tratamiento antibiótico

La utilización de este tipo de biomarcador trae beneficios como disminución del tiempo de tratamiento, reducción de efectos secundarios, disminución de costos y mortalidad. Este tipo de marcador es útil en el sentido de que definiría cuando iniciar, suspender o cambiar el tratamiento antibiótico en función de sus niveles séricos.

Bibliografía consultada:

Samsudin, I., & Vasikaran, S. D. (2017). Clinical Utility and Measurement of Procalcitonin. The Clinical biochemist. Reviews, 38(2), 59–68.

Cleland DA, Eranki AP. Procalcitonin. [Updated 2020 Sep 3]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK539794/

Dímero D

Introducción

El dímero D es un biomarcador de la formación y degradación de fibrina. En pacientes normales se encuentra en baja cantidad, pero su elevación se relaciona a condiciones relacionadas con trombosis como el tromboembolismo venoso y la coagulación intravascular diseminada (CID). Su medición se introdujo en la década de los 70 para diagnosticar la CID y actualmente su campo de aplicación aumento siendo en esta pandemia un biomarcador útil de mal pronóstico en pacientes infectados por COVID-19

Formación del Dímero D

El dímero D es un producto de degradación de la fibrina reticulada. Para la formación del dímero D se requiere la activación de tres enzimas, la trombina, el factor XIII activado y la plasmina. El proceso inicia cuándo la trombina generada por el sistema de coagulación convierte al fibrinógeno en monómeros de fibrina, los monómeros de fibrina consisten en tres cadenas polipeptídicas entrelazadas, por lo tanto, tienen una región central denominada como E y dos regiones periféricas denominadas como D, posterior a la formación de fibrina ocurre una polimerización espontanea de los monómeros de fibrina a manera de “escalera” formando las protofibrillas de fibrina de doble hebra. Estas protofibrillas son inestables, por lo que el factor XIIIa refuerza los polímeros reticulando a los dominios de formando Dímeros D, posteriormente la plasmina empieza a degradar la fibrina en los sitios (DD)E, se liberan estos fragmentos y posteriormente la plasmina divide al dímero D (DD) del fragmento E circulando en la sangre por alrededor de 8 horas y posteriormente es eliminado por vía renal o por el sistema retículo endotelial (Figura 1).

Recomendaciones preanalíticas para la determinación de Dímero D

  • Equipo alado

Se recomiendan agujas con un calibre de 19 a 22 G, se sugiere utilizar un tubo de descarte para eliminar el “aire de la manguera”, ya que puede afectar al volumen de llenado, no se ha demostrado que existe una variabilidad significante entre este método de toma de muestras y otros, pero si se estudiaran otras pruebas de coagulación no se recomienda esta metodología. Por lo que solo se debe utilizar en pacientes en los que se complica la toma de muestra como oncológicos, geriátricos, urgencias y pediatría.

  • Material del tubo

Se prefiere tubo no activante como el vidrio o plástico de polipropileno, según varios estudios demostraron que todos los tubos comerciales para pruebas de coagulación no mostraron diferencias significativas y son recomendables para la prueba.

  • Anticoagulante

Actualmente se recomienda el uso de citrato de sodio al 3.2%, aunque dependiendo la metodología se puede utilizar plasma heparinizado o con EDTA. Es recomendable cuidar la proporción de anticoagulante-sangre para evitar la subestimación del Dímero D y recordar mezclar perfectamente la muestra 30 segundos después de la flebotomía.

  • Torniquete

Es importante recordar que no debe de estar mas de un minuto colocado el torniquete ya que se pueden formar coágulos y se ha observado que el uso prolongado del torniquete aumenta los valores del Dímero D.

  • Centrifugación

Las muestras se recomiendan centrifugar a 1500 g por 15 minutos, en caso de tener prisa por medir el dímero se puede centrifugar a 4500 g por 2 minutos. Algunos estudios establecen que el dímero D es estable en muestras sin centrifugar a temperatura ambiente por 8 horas y a 4°C por 24 horas.

Tipos de ensayos para determinar Dímero D

Actualmente en el mercado existen distintos ensayos para determinar el Dímero D y en la siguiente tabla se resume los que existen, así como las características que presentan:

Bibliografía consultada

Linkins, L. A., & Takach Lapner, S. (2017). Review of D-dimer testing: Good, Bad, and Ugly. International journal of laboratory hematology, 39 Suppl 1, 98–103. https://doi.org/10.1111/ijlh.12665

Weitz, J. I., Fredenburgh, J. C., & Eikelboom, J. W. (2017). A Test in Context: D-Dimer. Journal of the American College of Cardiology, 70(19), 2411–2420. https://doi.org/10.1016/j.jacc.2017.09.024

Favresse, J., Lippi, G., Roy, P. M., Chatelain, B., Jacqmin, H., Ten Cate, H., & Mullier, F. (2018). D-dimer: Preanalytical, analytical, postanalytical variables, and clinical applications. Critical reviews in clinical laboratory sciences, 55(8), 548–577. https://doi.org/10.1080/10408363.2018.15297

Efecto de las propiedades de líquidos en el pipeteo

Introducción

Las pipetas que se utilizan hoy en día en los laboratorios se suelen ajustar para suministrar el volumen deseado con agua. Como líquido de referencia, el agua es aceptada por las autoridades, ya que las propiedades físicas del agua son bien conocidas en diferentes condiciones ambientales. Sin embargo, en un entorno de laboratorio real, la transferencia de líquido siempre está influenciada por una combinación de muchos factores. Las propiedades de los líquidos pertenecen a estos factores y pueden tener un efecto considerable sobre los volúmenes dispensados. Aquí se analiza la influencia de varias propiedades.

Los temas tratados en este artículo se han publicado anteriormente. Aquí se han abordado diferentes factores con más detalle.

Explicaciones de conceptos

En este artículo se aplican las siguientes definiciones:

Calibración = determinación de la diferencia entre el volumen medio de la serie de medidas y el volumen seleccionado en la pantalla de la pipeta.

Ajuste = alteración de la configuración de la pipeta para que el volumen real se corresponda con el volumen seleccionado.

CV% = coeficiente de variación, un valor relativo obtenido a partir de la desviación estándar estadística y el valor medio de las mediciones.

Propiedades del líquido que influyen en los resultados del pipeteo

La mayoría de las pipetas utilizadas en los laboratorios utilizan el principio de pistón de aire. Esto significa que hay un espacio de aire entre el líquido y el pistón real. La mayoría de los líquidos se pueden transferir con mayor precisión con una pipeta de pistón de aire que con una pipeta de desplazamiento positivo (basado en el contacto directo entre el líquido y el pistón). Sin embargo, algunas características del líquido y factores ambientales pueden causar desviaciones en el suministro de líquido. El comportamiento diferente es posible gracias al espacio de aire existente y esto debe tenerse en cuenta cuando se utilizan pipetas.

Los enfoques teóricos y empíricos para explicar las influencias observadas se han discutido en el material de apoyo para el usuario final proporcionado por varios fabricantes de pipetas. Sin embargo, puede resultar difícil aplicar teorías científicas a situaciones prácticas.

La transferencia de líquido real siempre está influenciada por una combinación de varios factores, incluidas las propiedades del líquido. Por lo tanto, la evaluación de un caso particular puede ser un desafío. Para facilitar el enfoque, aquí se explican varios factores individuales. Por tanto, se puede comprender mejor el efecto combinado.

Densidad liquida

Con las pipetas de pistón de aire, el espacio de aire entre el líquido y el pistón actúa de manera similar a un resorte. Esto significa que cuando se ajusta una pipeta para entregar un volumen exacto de agua, la misma pipeta entrega un volumen mayor de un líquido de menor densidad. Esto se debe a que el mismo volumen que se obtuvo con agua es más ligero con el líquido menos denso. El espacio de aire (resorte) no está en un estado de equilibrio con este volumen y, por lo tanto, aspira el líquido un poco más que con agua. Un efecto inverso es causado por un líquido más denso. La densidad más alta impone una fuerza incrementada en el espacio de aire, lo que hace que se estire y da como resultado que se aspire un volumen de líquido más pequeño hacia la punta.

El efecto de la densidad se puede reducir transfiriendo una cantidad diferente de líquido. No se recomienda ajustar el volumen de suministro para que corresponda con la configuración de la pantalla a otros líquidos que no sean agua. Esto se debe a que las pipetas se utilizan para administrar varios líquidos diferentes, cada uno con propiedades diferentes. El uso de un líquido de referencia como el agua es más fiable para seguir el rendimiento de la pipeta. El efecto de otros líquidos se puede evaluar calibrando y cambiando el volumen suministrado en consecuencia (es decir, si el resultado de la calibración da un volumen 5 μl menor en el ajuste de 500 μl, la corrección se puede realizar ajustando el volumen de suministro a 505 μl para compensar la diferencia).

La densidad siempre tiene un efecto combinado con otros factores y, por lo tanto, es difícil presentar buenos ejemplos. Las soluciones de sales inorgánicas se pueden usar como una sola. Con un ajuste de 1000 μl, la pipeta da aproximadamente 1 μl de valores de volumen más pequeños al pipetear una solución saturada de NaCl y agua en comparación con el agua pura. Otra solución salina puede dar resultados diferentes. La Figura 1 muestra los resultados con dos soluciones salinas (solución saturada de NaCl y solución de Na2CO3 al 20% en peso) en comparación con agua pura. Se utilizó una punta estándar FT 1000.

Figura 1: Efecto de la densidad del líquido sobre el volumen de suministro. Diferencias entre agua, solución saturada de NaCl y solución de Na2CO3 al 20%. La variación de la medición individual se muestra junto con el valor promedio de los resultados de la prueba.

Presión de vapor y evaporación

Cada líquido forma un equilibrio entre los estados líquido y gaseoso. Para alcanzar este equilibrio, el líquido se evapora hasta que se presenta una cierta concentración en la atmósfera circundante. La presión de vapor es una propiedad del líquido que describe la rapidez con la que el líquido tiende a alcanzar el punto de equilibrio.

Los líquidos con una gran presión de vapor comienzan a evaporarse en el espacio de aire de la punta cuando el líquido se aspira en la punta. El espacio de aire se expande debido al líquido evaporado y, como no hay otra forma de aliviar la presión, el líquido comienza a salir a través del orificio de la punta. Esto a menudo se considera erróneamente como una fuga, cuando en realidad es un fenómeno natural. Las primeras dosis de una serie de pipeteo también dan volúmenes más pequeños, ya que la expansión de la fase gaseosa evita que parte del líquido entre en la punta.

La evaporación es un fenómeno continuo. Por lo tanto, es bueno recordar que los líquidos volátiles también se evaporan durante la dispensación. El volumen que entra en el vaso objetivo es menor que la cantidad que había en la punta antes de dispensar. Esto puede ser notable especialmente con volúmenes pequeños.

Para reducir los efectos de la evaporación, se recomienda humedecer previamente la punta. Aspirar y dispensar el líquido un par de veces acerca el espacio de aire al punto de equilibrio. Durante la serie de dosificación real después del prehumedecimiento, la diferencia entre las dosis es menor y el fenómeno de “fugas” es insignificante.

Vale la pena señalar que algunos líquidos, como los alcoholes, tienen el llamado efecto limpiaparabrisas. La grasa lubricante de la pipeta se puede quitar de las superficies deslizantes después de varios pipeteos y el pistón comienza a atascarse. Esto se puede solucionar moviendo el émbolo unas cuantas veces sin el líquido para volver a esparcir la grasa.

Figura 2: La evaporación hace que el líquido se escurra a través del orificio de la punta si la punta no está prehumedecida. A la derecha una punta seca y a la izquierda una punta prehumedecida con una solución de etanol coloreada 15 s después de la aspiración.

Viscosidad

La viscosidad es una propiedad que restringe el movimiento. Por lo tanto, un líquido con una viscosidad alta (por ejemplo, glicerol) entra y sale de la punta muy lentamente. Si la punta se retira demasiado pronto del depósito de líquido, también se introduce una burbuja de aire en la punta, lo que reduce el volumen de líquido.

Durante la dispensación, los líquidos viscosos dejan una película en las paredes de la punta y la película fluye hacia abajo más lentamente que la mayor parte de la masa líquida. Si el émbolo se presiona demasiado rápido, parte del líquido permanece en la punta debido a este movimiento lento.

Los resultados se pueden mejorar reduciendo la velocidad de pipeteo. La aspiración lenta permite que el líquido alcance un nivel de equilibrio y la dispensación lenta reduce el efecto de la película de retención de líquido. Además, es útil utilizar la técnica de pipeteo inverso, que también reduce el efecto de retención de líquidos. El uso de puntas de orificio ancho facilita la aspiración y dispensación de líquido, lo que permite que el líquido se mueva más libremente a través del orificio de la punta.

La figura 3 muestra el efecto de la técnica de pipeteo utilizada sobre los resultados con glicerol. Las curvas son valores promedio de tres series de mediciones separadas con cada técnica. Se han tenido en cuenta las precauciones mencionadas anteriormente. Los valores de CV% individuales variaron del 0.69% al 1.15% con el método directo y del 0.27% al 0.50% con el método inverso. El uso del método inverso reduce la desviación del resultado, pero también aumenta el volumen debido a una columna de líquido más alta. La pipeta se ajustó para glicerol utilizando el método directo.

Figura 3: Pipeteo de resultados con glicerol utilizando el método directo y el método inverso. La pipeta se ajustó para glicerol utilizando el método directo

Tensión superficial

La tensión superficial describe a la resistencia de las fuerzas intermoleculares que mantienen unida la masa del líquido. Un buen ejemplo de líquido con alta tensión superficial es el agua.

Los tensioactivos como Tween se utilizan en varias aplicaciones de laboratorio actuales, como los inmunoensayos en microplacas. Los aditivos utilizados reducen la tensión superficial del medio, lo que, por ejemplo, mejora la especificidad del análisis.

Debido a que los tensioactivos reducen la tensión superficial, cambia la capacidad humectante del líquido. Una película muy fina de líquido permanece en las paredes de la punta, fluyendo hacia abajo más lentamente que la mayor parte de la masa líquida. El efecto se asemeja al comportamiento de los líquidos viscosos, pero la película líquida restante es mucho más fina. A veces, con líquidos incoloros, la película es indetectable. Después del movimiento de dispensación, es posible que todavía quede algo de líquido en la punta.

Los aditivos también pueden provocar una tendencia a la formación de espuma en los líquidos. Debido a esto, parte del líquido puede quedar atrapado en la espuma y permanecer en la punta después de la dispensación. Esto se debe a que el volumen combinado del líquido y la espuma suele ser mayor que el volumen del movimiento de dispensación. La espuma también puede causar alteraciones no deseadas en otros procedimientos de aplicación (por ejemplo, mediciones fotométricas).

El efecto de una tensión superficial reducida se puede reducir reduciendo la velocidad de pipeteo. Además, el efecto de retención de líquido se puede reducir utilizando la técnica de pipeteo inverso.

Discusión

Las propiedades físicas de los líquidos pueden provocar desviaciones notables en los procesos de manipulación de líquidos a menos que se tengan en cuenta. Estas propiedades provocan diferentes comportamientos en la dosificación de líquidos, según la situación. Es posible reducir los efectos observados cambiando, por ejemplo, la velocidad de pipeteo y la técnica de pipeteo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las propiedades de los líquidos no son los únicos factores que influyen, sino que el resultado es siempre una combinación de diferentes fenómenos. Por lo tanto, se debe realizar una calibración para confirmar el efecto real.

Referencias:

1) Koivisto, S., The Tip of Perfection, Factors Affecting Pipetting Performance, Laboratory Equipment 8 (2007) 38-40.

2) International standard, EN ISO 8655 Piston-operated volumetric apparatus, ISO, Geneva 2002.

Nota: la traducido y modificado fue realizada por el equipo de EduLabC con fines de difusión del documento: Koivisto, S (2009). Effect of Liquid Properties in Pipetting, Liquid Handling Note – No. 1. Thermo Fisher Scientific. El texto original, así como las fotografías son propiedad de Thermo Fisher Scient.

Leucemia mieloide crónica

Introducción

La leucemia mieloide crónica (LMC) es una neoplasia mieloproliferativa que tiene una incidencia de 1 a 2 casos por cada 100 000 habitantes, tan solo en estados unidos tiene una incidencia de 9 000 casos/año. Esta entidad representa el 15% del total de leucemias que se diagnostican. Los hombres tienen una tendencia mayor a sufrir esta neoplasia en una proporción 1.3:1 respecto a las mujeres y su edad media de aparición es alrededor de los 53 años.

Patogénesis

La mayoría de pacientes con LMC presentan el cromosoma Filadelfia. Inicialmente en 1960 se describió como un cromosoma 22 cortado, pero posteriormente se identificó que se trataba de una traslocación (9:22). Esta traslocación yuxtapone secuencias de la región BCR del cromosoma 22 al brazo largo el cromosoma 9, creando un gen y una proteína de fusión BCR-ABL. Esta proteína tiene actividad quinasa, transfiere grupos fosfato del ATP a residuos de tirosina de varios sustratos, esto provoca la proliferación excesiva de células mieloides.

Manifestaciones clínicas y etapas.

La LMC se clasifica en tres etapas: la fase crónica, acelerada y blástica, dependiendo la fase tiene una presentación clínica diferente. Por ejemplo, la fase crónica se puede presentar asintomática o puede presentar signos y síntomas como:

  • Fatiga
  • Pérdida de peso
  • Malestar
  • Saciedad fácil
  • Dolor en el cuadrante superior izquierdo

Estos síntomas se exacerban en la fase acelerada y en la fase blástica el cuadro se complica y se presentan hemorragias, fiebre e infecciones.

Diagnóstico

La LMC en fase crónica se sospecha cuando el paciente muestra un recuento de leucocitos >50 000/µL aunque en muchos casos exceden los 100 000, en el extendido de sangre periférica se observan granulocitos en distintas etapas de maduración (blastos hasta segmentados) pero comúnmente existe mayor proporción de mielocitos y segmentados, también se observa aumento de basófilos y eosinófilos, en la fase crónica es común encontrar <10% de blastos. Se sospecha que el paciente se encuentra en fase acelerada, cuando presenta un porcentaje de blastos entre 10 y 19% y la fase blástica cuando los blastos son >20%.

El inmunofenotipo no es útil en el diagnóstico inicial de la LMC, ya que no ayuda a diferenciar una leucocitosis reactiva de una neoplásica, pero cuando la leucemia se encuentra en fase blástica si puede tener utilidad el inmunomarcaje cuando no hay un diagnóstico previo.

Las técnicas de citogenética son importantes para la búsqueda de la traslocación 9:22 ya sea por cariotipo o FISH, esta última presenta una sensibilidad del 100% para la detección de BCR-ABL.

Técnica de FISH, en la que se observa la unión de BCR-ABL

Bibliografía consultada

Jabbour, E., & Kantarjian, H. (2020). Chronic myeloid leukemia: 2020 update on diagnosis, therapy and monitoring. American journal of hematology95(6), 691–709.

Mauro, M. J., & Druker, B. J. (2001). Chronic myelogenous leukemia. Current Opinion in Oncology, 13(1), 3–7.

Pavón Morán, Valia, Hernández Ramírez, Porfirio, Martínez Antuña, Gisela, Agramonte Llanes, Olga, Jaime Fagundo, Juan Carlos, & Bravo Regueiro, Jeny. (2005). Leucemia mieloide crónica: Actualización en Citogenética y Biología Molecular. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, 21(2)

Relación albúmina-creatinina

Introducción

En pacientes normales se excreta aproximadamente <30 gramos/día de albúmina, en pacientes con enfermedad renal existe una disminución de la permeabilidad glomerular por lo que esta proteína es filtrada libremente. Por esta razón la evaluación de albumina es de suma importancia en el diagnóstico y seguimiento de las patologías que afectan el glomérulo ya que son un buen marcador de progresión de la enfermedad renal.

Existen varios métodos para determinar la albuminuria en pacientes con enfermedad renal, el estándar de oro se considera la determinación de albúmina o proteínas en una orina de 24 horas. Pero presenta varios inconvenientes principalmente en la recolección de la muestra, ya que es necesario guardar toda la orina de un día y preservar adecuadamente la muestra, pero en muchos establecimientos la información otorgada al paciente respecto a la toma de muestra es poco clara y conlleva a una mala recolección. Por esta razón, se ha optado por determinar la proteinuria o albuminuria en una sola muestra de orina idealmente la primera orina de la mañana, y se a demostrado en muchos estudios que se correlaciona muy bien con la determinación de 24 horas y es recomendada por muchas guías internacionales que evalúan el daño renal (KDIGO, KDOQI, NKDEP), también se ha observado que es muy sensible esta determinación en pacientes diabéticos con albuminuria de baja concentración.

Albuminuria en primera orina de la mañana

Idealmente es la primera orina de la mañana ya que orinas obtenidas al azar en el transcurso del día pueden tener variaciones respecto a la excreción de proteínas. La determinación de la albuminuria en una orina obtenida a primera hora de la mañana se debe evaluar mediante la relación albúmina-creatinina, ya que la concentración de albúmina esta sujeta a la concentración urinaria, en muestras muy diluidas puede existir una proteinuria o albuminuria, pero al estar muy diluida la cuantificación arrojara valores normales, caso contrario sucede en las orinas concentradas la determinación arrojara valores falsamente positivos si solo se cuantifica albúmina. Por esta razón es necesario normalizar la concentración de la albúmina con la tasa de filtración glomerular mediante la creatinuria.

Recomendaciones

La evaluación de la relación albúmina-creatinina se debe realizar 3 veces en un plazo no mayor a un mes para evitar sobrediagnóstico, si dos de las determinaciones muestran valores >30 mg/gr que es equivalente a una excreción de albúmina >30 mg/24 horas se considera un diagnóstico positivo de albuminuria.

La evaluación de la albuminuria se debe evitar si el paciente presenta fiebre, situaciones de estrés, realizó ejercicio intenso, presenta una ITU o se encuentra menstruando, ya que pueden ocasionar un valor falsamente positivo.

Algunas guías sobre uroanálisis recomiendan cuantificar la albumina usando la relación albúmina-creatinina en población diabética y adultos, en niños evaluar la relación proteínas-creatinina

Valores de referencia

Los valores de referencia varían, algunos autores mencionan que la prueba se considera positiva a albuminuria cuando es >30 mg/gr, pero los valores que presentan mayor consenso internacional son; Hombres >17 mg/gr y mujeres >25 mg/gr, aunque estos valores se originaron en una población diabética. Por lo que Montañés Bermúdez et al. (2011) proponen que en población no diabética el valor de referencia sea <30 mg/gr y en población diabética <17 mg/gr en hombres y <25 mg/gr en mujeres.

Microalbuminuria y macroalbuminuria.

En cuanto a la clasificación de microalbuminuria y macroalbuminuria cada guía que existe establece valores propios por lo que existe mucha confusión en el establecimiento de ambas entidades, por lo que algunos autores recomiendan no clasificarlas y hablar solamente de albuminuria.

Bibliografía consultada

Carvajal-Carvajal, C., 2017. Proteinuria y microalbuminuria. Medicina Legal de Costa Rica, 34(1).

Montañés Bermúdez, R. et al., 2011. Documento de consenso. Recomendaciones sobre la valoración de la proteinuria en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad renal crónica. Nefrología (Madrid), 31(3), pp.331–345..

Montero, N. et al., 2012. Correlación entre el cociente proteína/creatinica en orina esporádica y las proteínas en orina de 24 horas. Nefrologia, 32(4), pp.494–501.

Park, J.I. et al., 2017. Comparison of urine dipstick and albumin:creatinine ratio for chronic kidney disease screening: A population-based study B. O. Tayo, ed. PLOS ONE, 12(2), p.e0171106.

COVID-19: todo lo que hay que saber

Introducción

A finales del 2019 aparece un cuadro de neumonía de origen desconocido en un grupo de pacientes, posteriormente se notificó que esta neumonía era causada por un nuevo coronavirus denominado COVID-19 que después el Comité Internacional de Nomenclatura de Virus lo denomino SARS-CoV-2. La presencia de COVID-19 en el organismo se manifiesta con varios síntomas, que pueden ser totalmente asintomáticos hasta enfermedad grave y causar la muerte.

Virología del coronavirus

Pertenece al género beta-CoVs y su nombre se debe a su apariencia en el microscopio electrónico, ya que se observan estructuras que irradia a manera de una corona, estas estructuras denominadas peplómeros pertenecen a una glicoproteína llamada “pico (S)”. La glicoproteína S, M y la proteína pequeña (E) se encuentran en la envoltura del virus. La glicoproteína S es un antígeno que tiene la función de unirse a los receptores celulares y realizar la fusión. Mientras que la glicoproteína M tiene la función de formar la envoltura y ensamblaje del virión. Por otro lado, el virus tiene un genoma de ARN monocatenario positivo con aproximadamente 26 – 32 Kpb, esta metilado en el extremo 5’ y tiene una cola de poli A en 3’. El ARN está asociada a la cápside (N) por la fosfoproteína básica.

Rutas de transmisión

Las rutas de transmisión pueden ser directos o indirectos, en el primer caso corresponde a la inhalación directa de gotitas liberadas al estornudar o toser y la trasmisión por contacto con la mucosa oral, nasal y ocular. Mientras que los mecanismos indirectos se refieren a la interacción con fómites o superficies contaminadas.

Manifestaciones clínicas

Las manifestaciones clínicas son inespecíficas, los síntomas comunes son fiebre, tos no productiva, mialgia y cansancio extremo. Otros síntomas menos comunes son diarrea, náuseas, dolor de cabeza, vómitos y dolor abdominal. Las personas que requieren mayores cuidados son aquellas que presentan comorbilidades como diabetes, hipertensión, enfermedad cardiovascular o trastornos neurológicos.

Patogenia

Hasta el momento no se ha dilucidado exactamente el proceso de patogénesis del SARS-CoV-2, pero todo parece apuntar a la tormenta de citocinas y a los efectos deletéreos de la angiotensina II.

Para que el virus entre a la célula la glicoproteína S se una a la enzima transformadora de angiotensina 2 (ACE2) en la célula diana. Esta unión ocasiona la internalización del complejo virus-ACE2, lo que lleva a la regulación a la baja de esta enzima y por lo tanto su disminución en las membranas celulares. Esto conlleva al aumento de la activación del eje angiotensina II (Ang II)-receptor de angiotensina tipo I (AT1R) y esta desregulación ocasiona:

  • La activación del sistema renina angiotensina aldosterona (RAAS) induce inflamación a través del receptor AT1R en riñón y vasculatura.
  • La activación de RAAS induce la secreción de enzimas profibróticas como el factor de crecimiento transformante beta.
  • El aumento de Ang II y AT1R se acompaña de una respuesta proinflamatoria a través de la activación de la cascada de complemento.
  • Hiperactividad de NK-kB que conduce a una mayor producción de IL-6, TNFα, IL-1B e IL-10 y por lo tanto contribuye a la tormenta de citocinas.
  • Después de la activación de AT1R, Ang II regula las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), que participan en la liberación de citocinas como IL-1, IL-10, IL-12. y TNFα.

Además de los mecanismos antes postulados, también se ha sugerido la activación del eje ACE2/DANK/bradicina B1 que conduce a un aumento de la liberación de citocinas lo que explicaría el evento de “tormenta de citocinas”. Si se quiere profundizar se recomienda consultar los artículos mostrados en la bibliografía.

Monitoreo de los pacientes con SARS-CoV-2 por el laboratorio

El papel esencial del laboratorio en esta pandemia va más allá del diagnóstico etiológico, el monitoreo es fundamental para evaluar la gravedad y progresión de la enfermedad. Varias pruebas de diagnostico in vitro se han relacionado a la progresión desfavorable. En la siguiente tabla se resumen las pruebas recomendadas para el monitoreo de estos pacientes según lo recomendado por la IFCC y su interpretación clínica.

Bibliografía consultada

Mahmudpour, M., Roozbeh, J., Keshavarz, M., Farrokhi, S., & Nabipour, I. (2020). COVID-19 cytokine storm: The anger of inflammation. Cytokine, 133, 155151. https://doi.org/10.1016/j.cyto.2020.155151

Sheervalilou, R., Shirvaliloo, M., Dadashzadeh, N., Shirvalilou, S., Shahraki, O., Pilehvar-Soltanahmadi, Y., Ghaznavi, H., Khoei, S., & Nazarlou, Z. (2020). COVID-19 under spotlight: A close look at the origin, transmission, diagnosis, and treatment of the 2019-nCoV disease. Journal of cellular physiology, 235(12), 8873–8924. https://doi.org/10.1002/jcp.29735

Esakandari, H., Nabi-Afjadi, M., Fakkari-Afjadi, J., Farahmandian, N., Miresmaeili, S. M., & Bahreini, E. (2020). A comprehensive review of COVID-19 characteristics. Biological procedures online, 22, 19. https://doi.org/10.1186/s12575-020-00128-2

Naserghandi, Alvand & Allameh, Seyed & Saffarpour, Reyhaneh. (2020). All about COVID-19 in brief. New Microbes and New Infections. 35. 100678. 10.1016/j.nmni.2020.100678.

Candiduria

Introducción

La presencia de levaduras (candiduria) en orina es un hallazgo común, Candida se encuentra colonizando de forma normal la mucosa urogenital, por lo que su hallazgo en sedimento urinario no indica la existencia de una infección y se debe descartar una contaminación, una colonización o una infección a nivel renal o del tracto urinario. Existen varios factores que predisponen a una infección por Candida y la mayoría se relaciona a una debilitación del sistema inmune o a una disbiosis, en la siguiente tabla se resumen los factores de riesgo que predisponen a una infección por este hongo.

Morfotipos de Candida

Candida es un hongo dimórfico que tiene plasticidad morfológica, hasta la fecha se han descrito 9 morfotipos y a continuación se abordan los más importantes.

Levaduras: su nombre correcto es blastoconidios, son unicelulares que se reproducen por gemación, estas aparecen como células de color verde pálido con paredes lisas y bien definida, el núcleo a veces visible, y el citoplasma es homogéneo sin organelos aparentes, la forma de la célula es generalmente ovoide, esférica o alargada.
Pseudohifas: son estructuras alargadas pero sus divisiones son por medio de constricciones por lo que cada célula tiene forma elipsoidal y no de un tubo continuo.
Hifas: son estructuras filamentosas multicelulares, con forma de tubo y que se dividen por medio de septos.

Patogenia de Candida en el tracto urinario

No se conoce mucho sobre la patogénesis de Candida en vejiga u otros órganos de la vía urinaria, pero si se han realizado varios estudios sobre la patogénesis de Candida en riñón, pero en general se considera que realiza eventos similares en ambos sitios.

Tanto de forma comensal como patógena de Candida necesita unirse a los ligandos celulares y poder colonizar. La adhesión esta mediada por una seria de proteínas (adhesinas) que median el anclaje a superficies bióticas y abióticas, dentro de estas proteínas se encuentra la familia de adhesinas Als y la proteína HWP1. En la adhesión inicial de la levadura a la célula, ocurre una estimulación en la formación de tubo germinativo/formación de hifa, esto con el fin de aumentar puntos de anclaje entre el hongo y la célula. En el caso de que el hongo sea patógeno inicia la invasión de las células huésped, y para realizar este fenómeno cuenta con dos mecanismos; la endocitosis inducida y la penetración activa. Estos mecanismos de invasión pueden ocurrir al mismo tiempo o no, y esto depende principalmente del tipo de célula, por ejemplo, en epitelio de la mucosa oral (escamoso estratificado) participan los dos, pero en epitelio intestinal solo la penetración activa. Por último, el hongo causa el daño tisular el cual terminara en muerte celular por apoptosis y necrosis causando abscesos, si el hongo alcanza algún vaso sanguíneo, se puede diseminar a otros órganos.

Diagnóstico de una ITU por Candida

El diagnóstico de las ITU por Candida es complicado, ya que no existe hasta la fecha un numero de corte de UFC que indique infección como es el caso de las bacterias, varios estudios han establecido que recuentos muy bajos de levaduras se presentan en pacientes con infección de Candida a nivel renal o recuentos muy elevados en pacientes colonizados. Si se observan levaduras en orina, lo primero que se debe realizar es descartar que no sea una contaminación, en caso de descartar la contaminación se deben cotejar los síntomas presentes, factores de riesgo y observar si existe leucocituria. Si el paciente es asintomático y continúa presentando candiduria, lo que se recomienda es evaluar que factores de riesgo están propiciando la colonización para modificarlos. En pacientes sondados es complicada su evaluación, ya que normalmente tienen leucocituria sin tener alguna infección, en caso de encontrar levaduras en este tipo de pacientes se recomienda cambiar la sonda y si en la segunda muestra obtenida de la sonda nueva hay levaduras, es indicativo de colonización vesical por lo que es necesario cultivar.

Bibliografía recomendada
• Kauffman, C. A., Fisher, J. F., Sobel, J. D. and Newman, C. A. (2011). Candida urinary tract infections – Diagnosis. Clinical Infectious Diseases, 52(SUPPL. 6.
• Bonifaz Trujillo, A. J. (2012) Micología Médica Básica. McGraw Hill Mexico.
• Naglik, J. R., Moyes, D. L., Wächtler, B. and Hube, B. (2011). Candida albicans interactions with epithelial cells and mucosal immunity.’Microbes and infection, 13(12–13), 963–76.
• Mayer, F. L., Wilson, D. and Hube, B. (2013). Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence, 4(2), 119–28.

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